O efeito de inibidores na amplificação de STRs autossómicos pelo kit Investigator® 26Plex QS

Abstract

A metodologia de PCR – reação em cadeia de polimerase – constitui-se como a metodologia de eleição na análise de amostras biológicas em Genética e Biologia Forenses. O material genético colhido em cenas de crime ou em cadáveres encontra-se frequentemente exposto ao meio ambiente e/ou a diferentes inibidores, levando a uma ineficiente amplificação dos marcadores genéticos. De entre os inibidores mais frequentemente encontrados em amostras problema incluem-se: etanol, índigo-carmim, solo argiloso, solo humoso e folhagem. Os mecanismos de ação destes inibidores contemplam uma ineficiente lise celular que impossibilita a ação da Taq polimerase e a extensão da cadeia nucleotídica. Em particular, o solo age como fator de inibição e de degradação, dado que os seus componentes minerais se ligam às partículas de ADN e alteram a conformação da molécula. Adicionalmente as plantas e microrganismos presentes no solo utilizam o material biológico depositado como fator de crescimento, degradando-o. Por conseguinte, verifica-se uma amplificação preferencial de alelos de menor dimensão e a ocorrência de drop-out alélico. Para aferir a capacidade do kit Investigator 26Plex QS da Qiagen, em produzir resultados válidos e interpretáveis na presença dos inibidores supramencionados, prepararam-se amostras simuladas a diferentes proporções Inibidor vs ADN, nomeadamente 1:10, 1:1 e 10:1. Para a conceção das soluções de inibidores utilizou-se solução stock de etanol a 70%, preparou-se uma solução de índigo-carmim a 12mM e no que diz respeito, à folhagem, solo argiloso e solo humoso, 1g de cada inibidor foi adicionado a aproximadamente 2mL de água nuclease free para a obtenção de uma mistura homogénea. Após a preparação das amostras simuladas compostas por ADN controlo e solução inibitória, estas foram introduzidas num lote de amostras não contaminadas para se averiguar a capacidade do kit manter o seu adequado desempenho e para determinar o quão informativos são os controlos de qualidade incluídos neste. Com este trabalho foi possível demonstrar que para as proporções 1:10 e 1:1, é possível obter perfis genéticos completos com elevada intensidade de fluorescência e sem o aparecimento de artefactos. Contudo, para concentrações elevadas de inibidor - em que o input máximo de ADN era 0,1 ng - verificou-se uma redução abruta na performance do kit de amplificação com drop-out alélico dos STRs de maior tamanho. Complementarmente, através deste ensaio verificou-se que os controlos de qualidade inclusos no kit da Qiagen não permitiram aferir pela presença de inibidores nas amostras, observando-se resultados similares entre as amostras simuladas e as do grupo controlo. Atendendo que a extração de ADN remove uma quantidade elevada de material exógeno de uma amostra, a concentração de inibidores aquando da amplificação será mais reduzida. Por conseguinte, os resultados deste trabalho demonstram que este kit de amplificação permite a obtenção de um perfil genético válido e robusto.