Implementação e validação do procedimento laboratorial para extração de RNA viral para diagnóstico do Covid-19, nos laboratórios da ESTBarreiro/IPS - Baleizão, Ana Raquel Parreirinha (My University, 2022)
A pandemia por SARS-CoV-2, veio mudar o mundo. Muita adaptação teve que ser feita em muito pouco tempo, para se conseguir uma frente de batalha vitoriosa no combate e diagnós tico do vírus. Muitos laboratórios quiseram juntar-se a este combate e por isso, tiveram que trabalhar para conseguir ser reconhecidos e validados por entidades competentes. O IPS CO VID Lab foi um desses laboratórios que conseguiu a validação das suas metodologias na deteção do SARS-COV-2. Em particular, a presente tese de mestrado aborda a extração de RNA de amostras biológicas, com vista à deteção de SARS-CoV-2, utilizando um kit comercial de extração de RNA viral com minicolunas de spin. Foram otimizados os procedimentos do kit de extração, para au mentar a concentração do RNA extraído, através do encurtamento dos passos e eliminação do uso de um dos tampões do kit. A validação do método otimizado foi feita pela quantificação do RNA extraído e pela técnica de deteção RT-qPCR (PCR quantitativo em tempo real com transcrição reversa). Preparou-se também um meio de inativação viral de transporte, in house, para avaliar o seu uso na inativação das amostras biológicas, em alternativa ao meio de inativação viral de trans porte comercial. O seu uso foi igualmente validado através da quantificação do RNA extraído e através da técnica de deteção RT-qPCR. Para dar resposta ao grande número de testagens a realizar no IPS COVID Lab, foi desen volvido um procedimento de preparação de amostras e extração com a formação de poolings, em que juntaram várias amostras e foi feita a sua extração em simultâneo. A utilização dos poolings de amostra foi validada comparando os valores de Cp das amostras extraídas indi vidualmente com os valores de Cp do pooling das mesmas amostras, obtidos pela técnica de deteção RT-qPCR. Investigou-se também a utilização da técnica de extração de RNA com a resina quelante Che lex 100, para as amostras inativadas em meio de inativação de transporte. Verificou-se que esta técnica não é compatível com o uso do meio de inativação de transporte, uma vez que após a extração de RNA, não se verifica amplificação de nenhum dos alvos genéticos com a técnica RT-qPCR, o que indica a presença de contaminantes inibidores das reações PCR. Fez-se também a comparação das deteções de SARS-CoV-2 através de testes rápidos de antigénio (TRAg) com as deteções pela técnica RT-qPCR em amostras biológicas colhidas dos mesmos indivíduos. Este estudo permitiu concluir relativamente à menor sensibilidade dos TRAgs em comparação com a sensibilidade dos testes de diagnóstico por RT-qPCR.

The SARS-CoV-2 pandemics came to change the world as we know it. Several adapta tions/modifications had to be done in a very short amount of time, to achieve a victorious bat tlefront in the fight and diagnosis of the virus. Many laboratories wanted to join this fight and therefore had to work to be recognized and validated by competent authorities. The IPS COVID Lab was one of those laboratories that achieved validation of its methodologies in the detection of SARS-COV-2. In particular, this master's thesis deals with the extraction of RNA from biological samples, with a view to the detection of SARS-CoV-2, using an extraction kit with mini spin columns. The extraction kit procedures were optimized to increase the concentration of extracted RNA, by shortening the steps and eliminating the use of one of the kit's buffers. The validation of the optimized method was performed by quantification of the extracted RNA and and through the RT-qPCR detection technique (quantitative real-time PCR with reverse transcription). An in-house transport viral inactivation medium was also prepared to evaluate its use in the inactivation of biological samples as an alternative to the commercial transport viral inactivation medium. It was validated through the quantification of the extracted RNA and through the RT qPCR detection technique. In order to respond to the large number of tests to be carried out at the IPS COVID Lab, a sample preparation and extraction procedure was developed with sample pools, in which sev eral samples were combined and extracted simultaneously. The use of sample pools was val idated by comparing the Cp (obtained through RT-qPCR) of individually extracted samples with the pooled Cp values of the same samples. The use of the RNA extraction technique with Chelex 100 chelating resin for inactivated sam ples in transport inactivation medium was also investigated. It was verified that this technique is not compatible with the use of transport inactivation medium, since after RNA extraction, amplification of none of the genetic targets is verified with the RT-qPCR technique, which in dicates the presence of contaminants that inhibit PCR reactions. A comparison was also performed between the detections of SARS-CoV-2 through rapid anti gen tests (TRAg) and detections by the RT-qPCR technique in biological samples collected from the same individuals. It was concluded that TRAgs had less sensitivity for the diagnostic tests than RT-qPCR.
Keywords: Extração; RNA; COVID-19; SARS-CoV-2; Chelex; Extraction